Получение специфичных к антигену CD87 CAR T-лимфоцитов и оценка их функциональной активности in vitro

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ , ,

М.В. Неклесова, С.В. Смирнов, А.А. Шатилова, К.А. Левчук, А.Е. Ершова, С.А. Силонов

НЦМУ «Центр персонализированной медицины», ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341

Для переписки: Сергей Владимирович Смирнов, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341; тел.: +7(964)612-57-14; e-mail: sergeiismirnoff@gmail.com

Для цитирования: Неклесова М.В., Смирнов С.В., Шатилова А.А. и др. Получение специфичных к антигену CD87 CAR T-лимфоцитов и оценка их функциональной активности in vitro. Клиническая онкогематология. 2022;15(4):340–8.

DOI: 10.21320/2500-2139-2022-15-4-340-348

РЕФЕРАТ

Цель. Создание анти-CD87 CAR T-лимфоцитов и оценка их функциональной активности in vitro.

Материалы и методы. Выделенные из периферической крови здорового донора Т-лимфоциты трансдуцировали лентивирусным вектором, кодирующим гены анти-CD87-CAR, T2A и FusionRed. Эффективность трансдукции, оцениваемая по уровню сигнала репортерного белка FusionRed, субпопуляционный состав и функциональное состояние CAR T-лимфоцитов определены методом проточной цитометрии. Экспрессия интерферона-γ (IFN-γ) CAR T-лимфоцитами изучалась с помощью иммуноферментного анализа. Оценка цитотоксической активности CAR T-лимфоцитов выполнялась при сокультивировании с клетками-мишенями HeLa с помощью системы анализа клеток в реальном времени xCELLigence.

Результаты. Эффективность трансдукции Т-лимфоцитов составила 8,4 %. Полученные CAR T-клетки содержали как маркеры активации CD27 и/или CD28 (92,91 % случаев), так и маркер истощения PD1 (20,66 %). В популяции CAR T-лимфоцитов фенотип Т-клеток центральной памяти составил 98,51 %, а соотношение CD4/CD8 — 1:7. Концентрация IFN-γ в среде после сокультивирования CAR T-лимфоцитов с клетками-мишенями оказалась значимо выше, чем в контрольных образцах. Показано, что полученные СAR T-лимфоциты проявляют специфическую цитотоксичность по отношению к клеткам-мишеням как немодифицированной, так и повышенной экспрессии антигена CD87 клеточных линий HeLa. Цитотоксичность оказалась более выраженной в отношении линии клеток с повышенной экспрессией антигена CD87.

Заключение. Несмотря на повышенную экспрессию маркера истощения PD1, CAR Т-лимфоциты продемонстрировали специфическую секрецию IFN-γ и выраженную цитотоксическую активность при взаимодействии с антигеном CD87 на мембране клеток-мишеней. Следовательно, анти-CD87 CAR Т-лимфоциты могут использоваться для лечения как гематологических, так и солидных опухолей. Поскольку наблюдаемая разница в цитотоксичности не коррелирует линейно с плотностью антигена CD87 на поверхности атакуемых клеток, при применении CAR T-клеточного препарата in vivo необходимо исключить вероятность цитотоксического воздействия на здоровые клетки, экспрессирующие CD87.

Ключевые слова: CD87, uPAR, CAR T-лимфоциты, острые миелоидные лейкозы.

Получено: 27 июня 2022 г.

Принято в печать: 10 сентября 2022 г.

Читать статью в PDF

Статистика Plumx русский

ЛИТЕРАТУРА

  1. Stoppelli MP, Corti A, Soffientini A, et al. Differentiation-enhanced binding of the amino-terminal fragment of human urokinase plasminogen activator to a specific receptor on U937 monocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 1985;82(15):4939–43. doi: 10.1073/pnas.82.15.4939.
  2. Behrendt N, Ronne E, Dano K. The structure and function of the urokinase receptor, a membrane protein governing plasminogen activation on the cell surface. Biol Chem Hoppe Seyler. 1995;376(5):269–79.
  3. Кугаевская Е.В., Гуреева Т.А., Тимошенко О.С., Соловьева Н.И. Система активатора плазминогена урокиназного типа в норме и при жизнеугрожающих процессах (обзор). Общая реаниматология. 2018;14(6):61–79. doi: 10.15360/1813-9779-2018-6-61-79.
    [Kugaevskaya EV, Gureeva TA, Timoshenko OS, Solovyeva NI. Urokinase-type plasminogen activator system in norm and in life-threatening processes (Review). General Reanimatology. 2018;14(6):61–79. doi: 10.15360/1813-9779-2018-6-61-79. (In Russ)]
  4. Mahmood N, Mihalcioiu C, Rabbani SA. Multifaceted Role of the Urokinase-Type Plasminogen Activator (uPA) and Its Receptor (uPAR): Diagnostic, Prognostic, and Therapeutic Applications. Front Oncol. 2018;8(2):8–24. doi: 10.3389/fonc.2018.00024.
  5. Alfano D, Gorrasi A, Li Santi A, et al. Urokinase receptor and CXCR4 are regulated by common microRNAs in leukaemia cells. J Cell Mol Med. 2015;19(9):2262–72. doi: 10.1111/jcmm.12617.
  6. Smith HW, Marshall CJ. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(1):23–36. doi: 10.1038/nrm2821.
  7. Gorantla B, Asuthkar S, Rao JS, et al. Suppression of the uPAR-uPA system retards angiogenesis, invasion, and in vivo tumor development in pancreatic cancer cells. Mol Cancer Res. 2011;9(4):377–89. doi: 10.1158/1541-7786.MCR-10-0452.
  8. Amor C, Feucht J, Leibold J, et al. Senolytic CAR T cells reverse senescence-associated pathologies. Nature. 2020;583(7814):127–32. doi: 10.1038/s41586-020-2403-9.
  9. Kusch A, Gulba D. Die Bedeutung des uPA/uPAR-Systems fur die Entwicklung von Arteriosklerose und Restenose. Z Kardiol. 2001;90(1):307–18. doi: 10.1007/s003920170160.
  10. Laurenzana A, Chilla A, Luciani C, et al. uPA/uPAR system activation drives a glycolytic phenotype in melanoma cells. Int J Cancer. 2017;141(6):1190–200. doi: 10.1002/ijc.30817.
  11. Ahmad A, Kong D, Sarkar SH, et al. Inactivation of uPA and its receptor uPAR by 3,3’-diindolylmethane (DIM) leads to the inhibition of prostate cancer cell growth and migration. J Cell Biochem. 2009;107(3):516–27. doi: 10.1002/jcb.22152.
  12. Fox SB, Taylor M, Grondahl-Hansen J, et al. Plasminogen activator inhibitor-1 as a measure of vascular remodelling in breast cancer. J Pathol. 2001;195(2):236–43. doi: 10.1002/path.931.
  13. Fisher JL, Field CL, Zhou H, et al. Urokinase plasminogen activator system gene expression is increased in human breast carcinoma and its bone metastases – a comparison of normal breast tissue, non-invasive and invasive carcinoma and osseous metastases. Breast Cancer Res Treat. 2000;61(1):1–12. doi: 10.1007/s10549-004-6659-9.
  14. Pierga JY, Bonneton C, Magdelenat H, et al. Real-time quantitative PCR determination of urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR) expression of isolated micrometastatic cells from bone marrow of breast cancer patients. Int J Cancer. 2005;114(2):291–8. doi: 10.1002/ijc.20698.
  15. Hildenbrand R, Schaaf A, Dorn-Beineke A, et al. Tumor stroma is the predominant uPA-, uPAR-, PAI-1-expressing tissue in human breast cancer: prognostic impact. Histol Histopathol. 2009;24(7):869–77. doi: 10.14670/HH-24.869.
  16. Boonstra MC, Verbeek FP, Mazar AP, et al. Expression of uPAR in tumor-associated stromal cells is associated with colorectal cancer patient prognosis: a TMA study. BMC Cancer. 2014;14:269. doi: 10.1186/1471-2407-14-269.
  17. Graf M, Reif S, Hecht K, et al. High expression of urokinase plasminogen activator receptor (UPA-R) in acute myeloid leukemia (AML) is associated with worse prognosis. Am J Hematol. 2005;79(1):26–35. doi: 10.1002/ajh.20337.
  18. Plesner T, Ralfkiaer E, Wittrup M, et al. Expression of the receptor for urokinase-type plasminogen activator in normal and neoplastic blood cells and hematopoietic tissue. Am J Clin Pathol. 1994;102(6):835–41. doi: 10.1093/ajcp/102.6.835.
  19. Bene MC, Castoldi G, Knapp W, et al. CD87 (urokinase-type plasminogen activator receptor), function and pathology in hematological disorders: a review. Leukemia. 2004;18(3):394–400. doi: 10.1038/sj.leu.2403250.
  20. Cummins KD, Gill S. Will CAR T cell therapy have a role in AML? Promises and pitfalls. Semin Hematol. 2019;56(2):155–63. doi: 10.1053/j.seminhematol.2018.08.008.
  21. Kramer MD, Spring H, Todd RF, et al. Urokinase-type plasminogen activator enhances invasion of human T cells (Jurkat) into a fibrin matrix. J Leukoc Biol. 1994;56(2):110–6. doi: 10.1002/jlb.56.2.110.
  22. Bianchi E, Ferrero E, Fazioli F, et al. Integrin-dependent induction of functional urokinase receptors in primary T lymphocytes. J Clin Invest. 1996;98(5):1133–41. doi: 10.1172/JCI118896.
  23. Xu Y, Zhang M, Ramos CA, et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 2014;123(24):3750–9. doi: 10.1182/blood-2014-01-552174.
  24. Sommermeyer D, Hudecek M, Kosasih PL, et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells derived from defined CD8+ and CD4+ subsets confer superior antitumor reactivity in vivo. Leukemia. 2016;30(2):492–500. doi: 10.1038/leu.2015.247.
  25. Baumeister SH, Murad J, Werner L, et al. Phase I Trial of Autologous CAR T Cells Targeting NKG2D Ligands in Patients with AML/MDS and Multiple Myeloma. Cancer Immunol Res. 2019;7(1):100–12. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-18-0307.
  26. Barber A, Meehan KR, Sentman CL. Treatment of multiple myeloma with adoptively transferred chimeric NKG2D receptor-expressing T cells. Gene Ther. 2011;18(5):509–16. doi: 10.1038/gt.2010.174.
  27. Roybal KT, Rupp LJ, Morsut L, et al. Precision Tumor Recognition by T Cells With Combinatorial Antigen-Sensing Circuits. Cell. 2016;164(4):770–9. doi: 10.1016/j.cell.2016.01.011.
  28. Brown JM, Wilson WR. Exploiting tumour hypoxia in cancer treatment. Nat Rev Cancer. 2004;4(6):437–47. doi: 10.1038/nrc1367.
  29. Kosti P, Larios-Martinez KI, Maher J, Arnold JN. Generation of hypoxia-sensing chimeric antigen receptor T cells. STAR Protoc. 2021;2(3):100723. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100723.