CAR T-лимфоциты

Получение специфичных к антигену CD87 CAR T-лимфоцитов и оценка их функциональной активности in vitro

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ , ,

М.В. Неклесова, С.В. Смирнов, А.А. Шатилова, К.А. Левчук, А.Е. Ершова, С.А. Силонов

НЦМУ «Центр персонализированной медицины», ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341

Для переписки: Сергей Владимирович Смирнов, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341; тел.: +7(964)612-57-14; e-mail: sergeiismirnoff@gmail.com

Для цитирования: Неклесова М.В., Смирнов С.В., Шатилова А.А. и др. Получение специфичных к антигену CD87 CAR T-лимфоцитов и оценка их функциональной активности in vitro. Клиническая онкогематология. 2022;15(4):340–8.

DOI: 10.21320/2500-2139-2022-15-4-340-348

РЕФЕРАТ

Цель. Создание анти-CD87 CAR T-лимфоцитов и оценка их функциональной активности in vitro.

Материалы и методы. Выделенные из периферической крови здорового донора Т-лимфоциты трансдуцировали лентивирусным вектором, кодирующим гены анти-CD87-CAR, T2A и FusionRed. Эффективность трансдукции, оцениваемая по уровню сигнала репортерного белка FusionRed, субпопуляционный состав и функциональное состояние CAR T-лимфоцитов определены методом проточной цитометрии. Экспрессия интерферона-γ (IFN-γ) CAR T-лимфоцитами изучалась с помощью иммуноферментного анализа. Оценка цитотоксической активности CAR T-лимфоцитов выполнялась при сокультивировании с клетками-мишенями HeLa с помощью системы анализа клеток в реальном времени xCELLigence.

Результаты. Эффективность трансдукции Т-лимфоцитов составила 8,4 %. Полученные CAR T-клетки содержали как маркеры активации CD27 и/или CD28 (92,91 % случаев), так и маркер истощения PD1 (20,66 %). В популяции CAR T-лимфоцитов фенотип Т-клеток центральной памяти составил 98,51 %, а соотношение CD4/CD8 — 1:7. Концентрация IFN-γ в среде после сокультивирования CAR T-лимфоцитов с клетками-мишенями оказалась значимо выше, чем в контрольных образцах. Показано, что полученные СAR T-лимфоциты проявляют специфическую цитотоксичность по отношению к клеткам-мишеням как немодифицированной, так и повышенной экспрессии антигена CD87 клеточных линий HeLa. Цитотоксичность оказалась более выраженной в отношении линии клеток с повышенной экспрессией антигена CD87.

Заключение. Несмотря на повышенную экспрессию маркера истощения PD1, CAR Т-лимфоциты продемонстрировали специфическую секрецию IFN-γ и выраженную цитотоксическую активность при взаимодействии с антигеном CD87 на мембране клеток-мишеней. Следовательно, анти-CD87 CAR Т-лимфоциты могут использоваться для лечения как гематологических, так и солидных опухолей. Поскольку наблюдаемая разница в цитотоксичности не коррелирует линейно с плотностью антигена CD87 на поверхности атакуемых клеток, при применении CAR T-клеточного препарата in vivo необходимо исключить вероятность цитотоксического воздействия на здоровые клетки, экспрессирующие CD87.

Ключевые слова: CD87, uPAR, CAR T-лимфоциты, острые миелоидные лейкозы.

Получено: 27 июня 2022 г.

Принято в печать: 10 сентября 2022 г.

Читать статью в PDF

Статистика Plumx русский

ЛИТЕРАТУРА

  1. Stoppelli MP, Corti A, Soffientini A, et al. Differentiation-enhanced binding of the amino-terminal fragment of human urokinase plasminogen activator to a specific receptor on U937 monocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 1985;82(15):4939–43. doi: 10.1073/pnas.82.15.4939.
  2. Behrendt N, Ronne E, Dano K. The structure and function of the urokinase receptor, a membrane protein governing plasminogen activation on the cell surface. Biol Chem Hoppe Seyler. 1995;376(5):269–79.
  3. Кугаевская Е.В., Гуреева Т.А., Тимошенко О.С., Соловьева Н.И. Система активатора плазминогена урокиназного типа в норме и при жизнеугрожающих процессах (обзор). Общая реаниматология. 2018;14(6):61–79. doi: 10.15360/1813-9779-2018-6-61-79.
    [Kugaevskaya EV, Gureeva TA, Timoshenko OS, Solovyeva NI. Urokinase-type plasminogen activator system in norm and in life-threatening processes (Review). General Reanimatology. 2018;14(6):61–79. doi: 10.15360/1813-9779-2018-6-61-79. (In Russ)]
  4. Mahmood N, Mihalcioiu C, Rabbani SA. Multifaceted Role of the Urokinase-Type Plasminogen Activator (uPA) and Its Receptor (uPAR): Diagnostic, Prognostic, and Therapeutic Applications. Front Oncol. 2018;8(2):8–24. doi: 10.3389/fonc.2018.00024.
  5. Alfano D, Gorrasi A, Li Santi A, et al. Urokinase receptor and CXCR4 are regulated by common microRNAs in leukaemia cells. J Cell Mol Med. 2015;19(9):2262–72. doi: 10.1111/jcmm.12617.
  6. Smith HW, Marshall CJ. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(1):23–36. doi: 10.1038/nrm2821.
  7. Gorantla B, Asuthkar S, Rao JS, et al. Suppression of the uPAR-uPA system retards angiogenesis, invasion, and in vivo tumor development in pancreatic cancer cells. Mol Cancer Res. 2011;9(4):377–89. doi: 10.1158/1541-7786.MCR-10-0452.
  8. Amor C, Feucht J, Leibold J, et al. Senolytic CAR T cells reverse senescence-associated pathologies. Nature. 2020;583(7814):127–32. doi: 10.1038/s41586-020-2403-9.
  9. Kusch A, Gulba D. Die Bedeutung des uPA/uPAR-Systems fur die Entwicklung von Arteriosklerose und Restenose. Z Kardiol. 2001;90(1):307–18. doi: 10.1007/s003920170160.
  10. Laurenzana A, Chilla A, Luciani C, et al. uPA/uPAR system activation drives a glycolytic phenotype in melanoma cells. Int J Cancer. 2017;141(6):1190–200. doi: 10.1002/ijc.30817.
  11. Ahmad A, Kong D, Sarkar SH, et al. Inactivation of uPA and its receptor uPAR by 3,3’-diindolylmethane (DIM) leads to the inhibition of prostate cancer cell growth and migration. J Cell Biochem. 2009;107(3):516–27. doi: 10.1002/jcb.22152.
  12. Fox SB, Taylor M, Grondahl-Hansen J, et al. Plasminogen activator inhibitor-1 as a measure of vascular remodelling in breast cancer. J Pathol. 2001;195(2):236–43. doi: 10.1002/path.931.
  13. Fisher JL, Field CL, Zhou H, et al. Urokinase plasminogen activator system gene expression is increased in human breast carcinoma and its bone metastases – a comparison of normal breast tissue, non-invasive and invasive carcinoma and osseous metastases. Breast Cancer Res Treat. 2000;61(1):1–12. doi: 10.1007/s10549-004-6659-9.
  14. Pierga JY, Bonneton C, Magdelenat H, et al. Real-time quantitative PCR determination of urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR) expression of isolated micrometastatic cells from bone marrow of breast cancer patients. Int J Cancer. 2005;114(2):291–8. doi: 10.1002/ijc.20698.
  15. Hildenbrand R, Schaaf A, Dorn-Beineke A, et al. Tumor stroma is the predominant uPA-, uPAR-, PAI-1-expressing tissue in human breast cancer: prognostic impact. Histol Histopathol. 2009;24(7):869–77. doi: 10.14670/HH-24.869.
  16. Boonstra MC, Verbeek FP, Mazar AP, et al. Expression of uPAR in tumor-associated stromal cells is associated with colorectal cancer patient prognosis: a TMA study. BMC Cancer. 2014;14:269. doi: 10.1186/1471-2407-14-269.
  17. Graf M, Reif S, Hecht K, et al. High expression of urokinase plasminogen activator receptor (UPA-R) in acute myeloid leukemia (AML) is associated with worse prognosis. Am J Hematol. 2005;79(1):26–35. doi: 10.1002/ajh.20337.
  18. Plesner T, Ralfkiaer E, Wittrup M, et al. Expression of the receptor for urokinase-type plasminogen activator in normal and neoplastic blood cells and hematopoietic tissue. Am J Clin Pathol. 1994;102(6):835–41. doi: 10.1093/ajcp/102.6.835.
  19. Bene MC, Castoldi G, Knapp W, et al. CD87 (urokinase-type plasminogen activator receptor), function and pathology in hematological disorders: a review. Leukemia. 2004;18(3):394–400. doi: 10.1038/sj.leu.2403250.
  20. Cummins KD, Gill S. Will CAR T cell therapy have a role in AML? Promises and pitfalls. Semin Hematol. 2019;56(2):155–63. doi: 10.1053/j.seminhematol.2018.08.008.
  21. Kramer MD, Spring H, Todd RF, et al. Urokinase-type plasminogen activator enhances invasion of human T cells (Jurkat) into a fibrin matrix. J Leukoc Biol. 1994;56(2):110–6. doi: 10.1002/jlb.56.2.110.
  22. Bianchi E, Ferrero E, Fazioli F, et al. Integrin-dependent induction of functional urokinase receptors in primary T lymphocytes. J Clin Invest. 1996;98(5):1133–41. doi: 10.1172/JCI118896.
  23. Xu Y, Zhang M, Ramos CA, et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 2014;123(24):3750–9. doi: 10.1182/blood-2014-01-552174.
  24. Sommermeyer D, Hudecek M, Kosasih PL, et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells derived from defined CD8+ and CD4+ subsets confer superior antitumor reactivity in vivo. Leukemia. 2016;30(2):492–500. doi: 10.1038/leu.2015.247.
  25. Baumeister SH, Murad J, Werner L, et al. Phase I Trial of Autologous CAR T Cells Targeting NKG2D Ligands in Patients with AML/MDS and Multiple Myeloma. Cancer Immunol Res. 2019;7(1):100–12. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-18-0307.
  26. Barber A, Meehan KR, Sentman CL. Treatment of multiple myeloma with adoptively transferred chimeric NKG2D receptor-expressing T cells. Gene Ther. 2011;18(5):509–16. doi: 10.1038/gt.2010.174.
  27. Roybal KT, Rupp LJ, Morsut L, et al. Precision Tumor Recognition by T Cells With Combinatorial Antigen-Sensing Circuits. Cell. 2016;164(4):770–9. doi: 10.1016/j.cell.2016.01.011.
  28. Brown JM, Wilson WR. Exploiting tumour hypoxia in cancer treatment. Nat Rev Cancer. 2004;4(6):437–47. doi: 10.1038/nrc1367.
  29. Kosti P, Larios-Martinez KI, Maher J, Arnold JN. Generation of hypoxia-sensing chimeric antigen receptor T cells. STAR Protoc. 2021;2(3):100723. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100723.

Биотехнология CAR-T и новые возможности лечения опухолевых заболеваний

ОБЗОРЫ ,

В.Ю. Павлова1, Е.С. Ливадный2

1 ГАУЗ «Кемеровская областная клиническая больница им. С.В. Беляева», Октябрьский пр-т, д. 22, корп. 2, Кемерово, Российская Федерация, 650066

2 ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный медицинский университет», ул. Ворошилова, д. 22а, Кемерово, Российская Федерация, 650056

Для переписки: Вера Юрьевна Павлова, канд. мед. наук, Октябрьский пр-т, д. 22, корп. 2, Кемерово, Российская Федерация, 650066; тел.: +7(951)570-57-86; e-mail: vera.4447.kem@mail.ru

Для цитирования: Павлова В.Ю., Ливадный Е.С. Биотехнология CAR-T и новые возможности лечения опухолевых заболеваний. Клиническая онкогематология. 2021;14(1):149–56.

DOI: 10.21320/2500-2139-2021-14-1-149-156

РЕФЕРАТ

Злокачественные новообразования как причина смерти занимают 2-е место в мире после сердечно-сосудистых заболеваний. CAR T-терапия (chimeric antigen receptor of T-cells) — прогрессивный метод лечения злокачественных опухолей. Использование CAR Т-лимфоцитов относится к адоптивной иммунотерапии. Технология CAR-T основана на «извлечении» клеток иммунной системы (Т-лимфоцитов) из организма, их генетической модификации в целях приобретения ими противоопухолевых свойств с последующей реинфузией пациенту. Преимущество CAR T-терапии в сравнении с другими методами лечения заключается в том, что для распознавания клеток-мишеней Т-лимфоциты не нуждаются в присутствии молекул главного комплекса гистосовместимости 1-го класса (MHC-I). Собранные и проанализированные нами литературные данные свидетельствуют о появлении принципиально нового эффективного метода лечения онкогематологических заболеваний, включая острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфолейкоз и неходжкинские лимфомы. На основании клинических исследований доказано преимущество CAR T-терапии в сравнении с другими методами лечения, применяющимися в данной области. Анализ литературы позволил сделать вывод об обоснованности рассмотрения CAR T-терапии как одной из перспективных возможностей воздействия на злокачественную опухоль.

Ключевые слова: адоптивная иммунотерапия, CAR T-лимфоциты, химерный антигенный рецептор.

Получено: 20 сентября 2020 г.

Принято в печать: 1 декабря 2020 г.

Читать статью в PDF

Статистика Plumx русский

ЛИТЕРАТУРА

  1. Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 2015;136(5):E359–Е386. doi: 10.1002/ijc.29210.
  2. Stewart BW, Wilde CP (eds). World cancer report 2014. Lyon: IARC Press, 2014. 619 p.
  3. Plummer M, de Martel C, Vignat J, et al. Global burden of cancers attributable to infections in 2012: a synthetic analysis. Lancet Glob 2016;4(9):e609–e616. doi: 10.1016/S2214-109X(16)30143-7.
  4. Состояние онкологической помощи населению России в 2018 году. Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2019. 236 с.
    [Caprin AD, Starinskii VV, Petrova GV, eds. Sostoyanie onkologicheskoi pomoshchi naseleniyu Rossii v 2018 godu. (The state of cancer care in Russia in 2018.) Moscow: MNIOI im. P.A. Gertsena — a branch of FGBU “NMITs radiologii” Minzdrava Rossii Publ.; 2019. 236 p. (In Russ)]
  5. Здравоохранение в России. Статистический сборник. М.: Росстат, 2011. 326 с.
    [Zdravookhranenie v Rossii. Statisticheskii sbornik. (Health care in Russia. Statistics digest.) Мoscow: Rosstat Publ.; 2011. 326 p. (In Russ)]
  6. Halaleh K, Gale RP. Cancer care in the Palestinian territoried. Lancet Oncol. 2018;19(7):e359–е364. doi: 10.1016/S1470-2045(18)30323-1.
  7. Чикилева И.О., Шубина И.Ж., Киселевский М.В. Влияние регуляторных Т-клеток на функциональную активность натуральных киллеров при иммунотерапии злокачественных опухолей. Вестник РАМН. 2012;67(4):60–4.
    [Chikileva IO, Shubina IZh, Kiselevskii MV. Influence of regulatory T-cells on the functioning of natural killer cells during cancer immunotherapy. Vestnik RAMN. 2012;67(4):60–4. (In Russ)]
  8. Титов К.С., Демидов Л.В., Шубина И.Ж. и др. Технологии клеточной иммунотерапии в лечении больных со злокачественными новообразованиями. Вестник Российского государственного медицинского университета. 2014;1:42–7.
    [Titov KS, Demidov LV, Shubina IZh, et al. Technologies of cell immunotherapy in treatment of cancer patients. Vestnik Rossiiskogo gosudarstvennogo meditsinskogo universiteta; 2014;1:42–7. (In Russ)]
  9. Wahlang B, Falkner KC, Cave MC, et al. Role of Cytochrome P450 Monooxygenase in Carcinogen and Chemotherapeutic Drug Metabolism. Adv Pharmacol. 2015;74:1–33. doi: 10.1016/bs.apha.2015.04.004.
  10. Janeway CA Jr, Travers P, Walport M, et al. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. New York: Garland Science, 2001. 884 p.
  11. Croce CM. Oncogenes and cancer. N Engl J Med. 2008;358(5):502–11. doi: 10.1056/NEJMra072367.
  12. Vicente-Duenas C, Romero-Camarero I, Cobaleda C, et al. Function of oncogenes in cancer development: a changing paradigm. EMBO J. 2013;32(11):1502–13. doi: 10.1038/emboj.2013.97.
  13. Den Haan JM, Arens R, Van Zelm MC. The activation of the adaptive immune system: cross-talk between antigen-presenting cells, T cells and B cells. Immunol Lett. 2014;162(2 Pt B):103–12. doi: 10.1016/j.imlet.2014.10.011.
  14. Emtage PC, Lo AS, Gomes EM, et al. Second-generation anti-carcinoembryonic antigen designer T cells resist activation-induced cell death, proliferate on tumor contact, secrete cytokines, and exhibit superior antitumor activity in vivo: a preclinical evaluation. Clin Cancer Res. 2008;14(24):8112–22. doi: 10.1158/1078-0432.
  15. Maher Immunotherapy of Malignant Disease Using Chimeric Antigen Receptor Engrafted T Cells. ISRN Oncol. 2012;2012:278093. doi: 10.5402/2012/278093.
  16. BonifantL, Jackson HJ, Brentjens RJ, et al. Toxicity and management in CAR T-cell therapy. Mol Ther. 2016;3:16011. doi: 10.1038/mto.2016.11.
  17. Xu J, Wang Q, Xu H, et al. Anti-BCMA CAR-T cells for treatment of plasma cell dyscrasia: case report on POEMS syndrome and multiple myeloma. J Hematol Oncol. 2018;11(1):128. doi: 10.1186/s13045-018-0672-7.
  18. Wang J, Chen S, Xiao W, et al. CAR-T cells targeting CLL-1 as an approach to treat acute myeloid leukemia. J Hematol Oncol. 2018;11(1):7. doi: 10.1186/s13045-017-0553-5.
  19. Wei J, Han X, Bo J, et al. Target selection for CAR-T therapy. J Hematol Oncol. 2019;12(1):62. doi: 10.1186/s13045-019-0758-x.
  20. Si W, Li C, Wei P. Synthetic immunology: T-cell engineering and adoptive immunotherapy. Synth Syst Biotechnol. 2018;3(3):179–85. doi: 10.1016/j.synbio.2018.08.001.
  21. Smith AJ, Oertle J, Warren D, Prato D. Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy for malignant cancers: Summary and perspective. J Cell Immunother. 2016;2(2):59–68. doi: 10.1016/j.jocit.2016.08.001.
  22. Chmielewski M, Abken H. Trucks: the fourth generation of CARs. Expert Opin Biol Ther. 2015;15(8):1145–54. doi: 10.1517/14712598.2015.1046430.
  23. Zhao Z, Chen Y, Francisco NM, et al. The application of CAR-T cell therapy in hematological malignancies: advantages and challenges. Acta Pharm Sin B. 2018;8(4):539–51. doi: 10.1016/j.apsb.2018.03.001.
  24. Brudno JN, Kochenderfer JN. Recent advances in CAR T-cell toxicity: Mechanisms, manifestations and management. Blood Rev. 2019;34:45–55. doi: 10.1016/j.blre.2018.11.002.
  25. Brudno JN, Maric I, Hartman SD, et al. T cells genetically modified to express an anti-B-cell maturation antigen chimeric antigen receptor cause remissions of poor prognosis relapsed multiple myeloma. J Clin Oncol. 2018;36(22):2267–80. doi: 10.1200/JCO.2018.77.8084.
  26. Maude SL, Frey N, Shaw PA, et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells for Sustained Remissions in Leukemia. N Engl J Med. 2014;371(16):1507–17. doi: 10.1056/NEJMoa1407222.
  27. Fernandez A Cure for Cancer? How CAR T-Cell Therapy is Revolutionizing Oncology. Available from: https://www.labiotech.eu/features/car-t-therapy-cancer-review/ (accessed 25.11.2020).
  28. Porter DL, Hwang WT, Frey NV, et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Sci Transl Med. 2015;7(303):303ra139. doi: 10.1126/scitranslmed.aac5415.
  29. Schuster SJ, Svoboda J, Chong EA, et al. Chimeric antigen receptor T cells in refractory B-cell lymphomas. N Engl J Med. 2017;377(26):2545–54. doi: 10.1056/NEJMoa1708566.
  30. Pule MA, Savoldo B, Myers GD, et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 2008;14(11):1264–70. doi: 10.1038/nm.1882.
  31. Kalos M, Levine BL, Porter DL, et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 2011;3(95):95ra73. doi: 10.1126/scitranslmed.3002842.
  32. Porter DL, Levine BL, Kalos M, et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 2011;365(8):725–33. doi: 10.1056/NEJMoa1103849.
  33. Riches JC, Gribben JG. Understanding the immunodeficiency in chronic lymphocytic leukemia: potential clinical implications. Hematol Oncol Clin North Am. 2013;27(2):207–35. doi: 10.1016/j.hoc.2013.01.003.
  34. Ellard R, Stewart O. The EBMT Guidelines for practice. A framework for managing Patient Care, CRS and Neurotoxicity. 1st European CAR T cell meeting, 14–16 February 2019, Paris, France.

Эффективная трансдукция Т-лимфоцитов лентивирусными частицами в онкоиммунологических исследованиях

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ,

Е.К. Зайкова1,2, К.A. Левчук1, Д.Ю. Поздняков1, А.А. Дакс2, А.Ю. Зарицкий1, А.В. Петухов1,2,3

1 ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341

2 Институт цитологии РАН, Тихорецкий пр-т, д. 4, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 194064

3 Научно-технологический университет «Сириус», Олимпийский пр-т, д. 1, Сочи, Российская Федерация, 354340

Для переписки: Екатерина Константиновна Зайкова, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341; e-mail: Catherine3452@yandex.ru

Для цитирования: Зайкова Е.К., Левчук К.A., Поздняков Д.Ю. и др. Эффективная трансдукция Т-лимфоцитов лентивирусными частицами в онкоиммунологических исследованиях. Клиническая онкогематология. 2020;13(3):295–306.

DOI: 10.21320/2500-2139-2020-13-3-295-306

РЕФЕРАТ

Цель. Сравнить разные методы концентрации лентивирусных частиц для выбора оптимального способа, обеспечивающего высокий уровень трансдукции для получения CAR T-клеток в лабораторных условиях.

Материалы и методы. Концентрирование лентивирусного супернатанта проводилось 4 способами: ультрафильтрацией, ультрацентрифугированием, осаждением водорастворимым неионным полимером полиэтиленгликолем (ПЭГ) и ионообменной хроматографией. Функциональный вирусный титр определяли как по экспрессии репортерного белка mCherry в трансдуцированной линии HeLa, так и экспресс-тестами, основанными на иммунохроматографическом анализе (ИХА). Физический титр определяли методом ELISA. Эффективность трансдукции Т-лимфоцитов здорового донора оценивали методом проточной цитометрии по интенсивности сигнала репортерного белка FusionRed. Функциональную активность полученных CAR T-клеток анти-CD19 оценивали с помощью микроскопии после совместного культивирования с клеточной линией CD19-HeLa+, а также последующего проведения теста на цитокины.

Результаты. Очистка и концентрирование лентивируса ультрафильтрацией позволили получить наивысшее число трансдуцированных клеток — 84,7 %. Методы ультрацентрифугирования, применения ПЭГ и ионообменной хроматографии продемонстрировали 56,08, 74,22 и 21,05 % трансдукции Т-клеток соответственно. Использование экспресс-тестов ИХА показало хорошую сопоставимость (r = 0,91) с данными, полученными титрованием на клеточной линии. Эффективность трансдукции Т-клеток в среднем составляла 59,55 ± 2,94 %, а максимальное значение достигало 76,26 %.

Заключение. В работе проведена оптимизация продукции CAR T-клеток на этапе получения лентивирусных векторов и их очистки. Метод ультрафильтрации был выбран как наиболее оптимальный способ концентрирования лентивирусного супернатанта, позволяющий осуществлять эффективную трансдукцию Т-лимфоцитов и генерировать функционально активную популяцию CAR T-клеток.

Ключевые слова: CAR T-лимфоциты, CD19, рекомбинантный лентивирус, концентрирование лентивирусного препарата.

Получено: 29 апреля 2020 г.

Принято в печать: 25 июня 2020 г.

Читать статью в PDF

ЛИТЕРАТУРА

  1. Blaese R, Culver K, Miller A, et al. T Lymphocyte-Directed Gene Therapy for ADA-SCID: Initial Trial Results After 4 Years. Science. 1995;270(5235):475–80. doi: 10.1126/science.270.5235.475.

  2. Kochenderfer J, Feldman S, Zhao Y, et al. Construction and Preclinical Evaluation of an Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor. J Immunother. 2009;32(7):689–702. doi: 10.1097/cji.0b013e3181ac6138.

  3. Brentjens R, Latouche J, Santos E, et al. Eradication of systemic B-cell tumors by genetically targeted human T lymphocytes co-stimulated by CD80 and interleukin-15. Nat Med. 2003;9(3):279–86. doi: 10.1038/nm827.

  4. Pule M, Savoldo B, Myers G, et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 2008;14(11):1264–70. doi: 10.1038/nm.1882.

  5. Kochenderfer J, Dudley M, Feldman S, et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor–transduced T cells. Blood. 2012;119(12):2709–20. doi: 10.1182/blood-2011-10-384388.

  6. Brentjens R, Davila M, Riviere I, et al. CD19-Targeted T Cells Rapidly Induce Molecular Remissions in Adults with Chemotherapy-Refractory Acute Lymphoblastic Leukemia. Sci Transl Med. 2013;5(177):177ra38. doi: 10.1126/scitranslmed.3005930.

  7. Lewinski M, Bushman F. Retroviral DNA Integration—Mechanism and Consequences. Adv Genet. 2005;55:147–81. doi: 10.1016/s0065-2660(05)55005-3.

  8. Kochenderfer J, Dudley M, Carpenter R, et al. Donor-derived CD19-targeted T cells cause regression of malignancy persisting after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2013;122(25):4129–39. doi: 10.1182/blood-2013-08-519413.

  9. Cruz C, Micklethwaite K, Savoldo B, et al. Infusion of donor-derived CD19-redirected virus-specific T cells for B-cell malignancies relapsed after allogeneic stem cell transplant: a phase 1 study. Blood. 2013;122(17):2965–73. doi: 10.1182/blood-2013-06-506741.

  10. Grupp S, Kalos M, Barrett D, et al. Chimeric Antigen Receptor–Modified T Cells for Acute Lymphoid Leukemia. N Engl J Med. 2013;368(16):1509–18. doi: 10.1056/nejmoa1215134.

  11. Kalos M, Levine B, Porter D, et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Sci Transl Med. 2011;3(95):95ra73. doi: 10.1126/scitranslmed.3002842.

  12. Qin D, Huang Y, Li D, et al. Paralleled comparison of vectors for the generation of CAR-T cells. Anticancer Drugs. 2016;27(8):711–22. doi: 10.1097/cad.0000000000000387.

  13. Gogol-Doring A, Ammar I, Gupta S, et al. Genome-wide Profiling Reveals Remarkable Parallels Between Insertion Site Selection Properties of the MLV Retrovirus and the piggyBac Transposon in Primary Human CD4+ T Cells. Mol Ther. 2016;24(3):592–606. doi: 10.1038/mt.2016.11.

  14. Izsvak Z, Hackett P, Cooper L, Ivics Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: Victories and challenges. BioEssays. 2011;33(6):478–9. doi: 10.1002/bies.201190025.

  15. Manuri P, Wilson M, Maiti S, et al. piggyBac Transposon/Transposase System to Generate CD19-Specific T Cells for the Treatment of B-Lineage Malignancies. Hum Gene Ther. 2010;21(4):427–37. doi: 10.1089/hum.2009.114.

  16. Nakazawa Y, Huye L, Salsman V, et al. PiggyBac-mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-specific Cytotoxic T-cells Expressing HER2-specific Chimeric Antigen Receptor. Mol Ther. 2011;19(12):2133–43. doi: 10.1038/mt.2011.131.

  17. Barrett D, Zhao Y, Liu X, et al. Treatment of Advanced Leukemia in Mice with mRNA Engineered T Cells. Hum Gene Ther. 2011;22(12):1575–86. doi: 10.1089/hum.2011.070.

  18. Dai X, Park J, Du Y, et al. One-step generation of modular CAR-T cells with AAV–Cpf1. Nat Meth. 2019;16(3):247–54. doi: 10.1038/s41592-019-0329-7.

  19. Mann R, Mulligan R, Baltimore D. Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus. Cell. 1983;33(1):153–9. doi: 10.1016/0092-8674(83)90344-6.

  20. Le Doux J, Davis H, Morgan J, Yarmush M. Kinetics of retrovirus production and decay. Biotechnol Bioeng. 1999;63(6):654–62. doi: 10.1002/(sici)1097-0290(19990620)63:6<654::aid-bit3>3.0.co;2-1.

  21. Andreadis S, Brott D, Fuller A, Palsson B. Moloney murine leukemia virus-derived retroviral vectors decay intracellularly with a half-life in the range of 5.5 to 7.5 hours. J Virol. 1997;71(10):7541–8. doi: 10.1128/jvi.71.10.7541-7548.1997.

  22. Naldini L, Blomer U, Gallay P, et al. In Vivo Gene Delivery and Stable Transduction of Nondividing Cells by a Lentiviral Vector. Science. 1996;272(5259):263–7. doi: 10.1126/science.272.5259.263.

  23. Sakuma T, Barry M, Ikeda Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochem J. 2012;443(3):603–18. doi: 10.1042/bj20120146.

  24. Dull T, Zufferey R, Kelly M, et al. A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J Virol. 1998;72(11):8463–71. doi: 10.1128/jvi.72.11.8463-8471.1998.

  25. Vannucci L, Lai M, Chiuppesi F, et al. Viral vectors: a look back and ahead on gene transfer technology. New Microbiol. 2013;36(1):1–22.

  26. Modlich U, Navarro S, Zychlinski D, et al. Insertional Transformation of Hematopoietic Cells by Self-inactivating Lentiviral and Gammaretroviral Vectors. Mol Ther. 2009;17(11):1919–28. doi: 10.1038/mt.2009.179.

  27. Sastry L, Xu Y, Duffy L, et al. Product-Enhanced Reverse Transcriptase Assay for Replication-Competent Retrovirus and Lentivirus Detection. Hum Gene Ther. 2005;16(10):1227–36. doi: 10.1089/hum.2005.16.1227.

  28. Cornetta K, Yao J, Jasti A, et al. Replication-competent Lentivirus Analysis of Clinical Grade Vector Products. Mol Ther. 2011;19(3):557–66. doi: 10.1038/mt.2010.278.

  29. Sena-Esteves M, Gao G. Titration of Lentivirus Vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(4):pdb.prot095695. doi: 10.1101/pdb.prot095695.

  30. Kutner R, Zhang X, Reiser J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc. 2009;4(4):495–505. doi: 10.1038/nprot.2009.22.

  31. Merten O, Hebben M, Bovolenta C. Production of lentiviral vectors. Mol Ther Meth Clin Devel. 2016;3:16017. doi: 10.1038/mtm.2016.17.

  32. Sena-Esteves M, Tebbets J, Steffens S, et al. Optimized large-scale production of high titer lentivirus vector pseudotypes. J Virol Meth. 2004;122(2):131–9. doi: 10.1016/j.jviromet.2004.08.017.

  33. Boudeffa D, Fenard D, Mormin M, et al. Development of Innovative Scalable Protocols for the Purification of Lentiviral Vectors Pseudotyped With GaLV-TR or Mutated Measles Virus Glycoproteins. Mol Ther. 2015;23:S214–S215. doi: 10.1016/s1525-0016(16)34143-0.

  34. Baekelandt V, Eggermont K, Michiels M, et al. Optimized lentiviral vector production and purification procedure prevents immune response after transduction of mouse brain. Gene Ther. 2003;10(23):1933–40. doi: 10.1038/sj.gt.3302094.

  35. Sanber K, Knight S, Stephen S, et al. Construction of stable packaging cell lines for clinical lentiviral vector production. Sci Rep. 2015;5(1):9021. doi: 10.1038/srep09021.

  36. Зайцев Д.В., Зайкова Е.К., Головкин А.С. и др. Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и технология CAR-T при солидных опухолях в эксперименте. Клиническая онкогематология. 2020;13(2):115–22. doi: 10.21320/2500-2139-2020-13-2-115-122.[Zaytsev DV, Zaikova EK, Golovkin AS, et al. Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor and CAR-T Technology for Solid Tumors in Experiment. Clinical oncohematology. 2020;13(2):115–22. doi: 10.21320/2500-2139-2020-13-2-115-122. (In Russ)]

  37. Петухов, А.В., Маркова, В.А., Моторин, Д.В. и др. Получение CAR T-лимфоцитов, специфичных к CD19, и оценка их функциональной активности in vitro. Клиническая онкогематология. 2018;11(1):1–9. doi: 10.21320/2500-2139-2018-11-1-1-9.[Petukhov AV, Markova VA, Motorin DV, et al. Manufacturing of CD19 Specific CAR T-Cells and Evaluation of their Functional Activity in Vitro. Clinical oncohematology. 2018;11(1):1–9. doi: 10.21320/2500-2139-2018-11-1-1-9. (In Russ)]

Получение CAR T-лимфоцитов, специфичных к CD19, и оценка их функциональной активности in vitro

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ , , , , , ,

А.В. Петухов1, В.А. Маркова2, Д.В. Моторин1, А.К. Титов1, Н.С. Белозерова2, П.М. Гершович2, А.В. Карабельский2, Р.А. Иванов2, Е.К. Зайкова1, Е.Ю. Смирнов2, П.А. Бутылин1, А.Ю. Зарицкий1

1 ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341

2 Биотехнологическая компания «Биокад», ул. Связи, д. 34-А, п. Стрельна, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 198515

Для переписки: Зарицкий Андрей Юрьевич, д-р мед. наук, профессор, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341; тел.: +7(812)702-68-28, факс: +7(812)702-37-65; e-mail: zaritskey@gmail.com

Для цитирования: Петухов А.В., Маркова В.А., Моторин Д.В. и др. Получение CAR T-лимфоцитов, специфичных к CD19, и оценка их функциональной активности in vitro. Клиническая онкогематология. 2018;11(1):1–9.

DOI: 10.21320/2500-2139-2018-11-1-1-9

РЕФЕРАТ

Актуальность. При В-линейных онкогематологических заболеваниях наиболее перспективный вариант адоптивной иммунотерапии предполагает применение клеток с химерным антигенным рецептором (CAR T-лимфоцитов), которые, по данным клинических исследований, продемонстрировали непревзойденные результаты.

Цель. Создание CAR T-лимфоцитов для применения в клинике и исследование их цитотоксичности in vitro.

Методы. Т-лимфоциты человека подвергались трансдукции лентивирусным вектором, содержащим гены анти-CD19-CAR, RIAD и GFP. Эффективность трансдукции Т-лимфоцитов оценивалась по уровню сигнала репортерного белка GFP методом проточной цитометрии. Для анализа жизнеспособности клеток применялся пропидия йодид. Цитотоксическая активность полученных CAR T-лимфоцитов в присутствии клеток-мишеней изучалась при их прямом сокультивировании. Анализ количества CAR T-клеток, экспрессии цитокинов проводился методом проточной цитометрии.

Результаты. Жизнеспособность трансдуцированных Т-лимфоцитов и экспрессия GFP достигали 91,87 и 50,87 % соответственно. При культивировании в присутствии IL-2 и рекомбинантного CD19 (целевой антиген) количество CAR T-лимфоцитов увеличивается в 1,4 раза через 120 ч относительно 48 ч. В цитотоксическом тесте при сокультивирования CAR-T с клетками K562-CD19+ доля CAR T-лимфоцитов увеличивается до 57 и 84,5 % после 48 и 120 ч экспозиции соответственно. В случае культивирования CAR T-лимфоцитов с клетками K562 (контрольная линия, не экспрессирующая CD19) через 48 ч их число снижалось до 36,2 %, а число K562 возрастало до 58,3 %. Жизнеспособность клеток-мишеней в экспериментальной и контрольной группах составила 3,5 и 36,74 % соответственно. Различия в концентрации IL-6 между контрольной и экспериментальной группами заметно меньше, чем при исследовании других цитокинов (IFN-γ, IL-2, TNF) в этих же группах.

Заключение. В настоящей работе были получены анти-CD19 CAR T-лимфоциты с достаточной жизнеспособностью. На модели in vitro продемонстрирована их цитотоксичность. Создание CAR T-лимфоцитов для клинического применения является первым шагом в развитии технологии адоптивной иммунотерапии в Российской Федерации.

Ключевые слова: CAR T-лимфоциты, иммуноадоптивная терапия, острый лимфобластный лейкоз, неходжкинские лимфомы, лентивирусная трансдукция, реакция «трансплантат против хозяина», синдром «цитокинового шторма».

Получено: 15 сентября 2017 г.

Принято в печать: 7 декабря 2017 г.

Читать статью в PDF 

ЛИТЕРАТУРА

  1. Kanakry CG, Fuchs EJ, Luznik L. Modern approaches to HLA-haploidentical blood or marrow transplantation. Nat Rev Clin Oncol. 2015;13(1):10–24. doi: 10.1038/nrclinonc.2015.128.
  2. Podhorecka M, Markowicz J, Szymczyk A, Pawlowski J. Target therapy in hematological malignances: new monoclonal antibodies. Int Sch Res Not. 2014;2014(3):1–16. doi: 10.1155/2014/701493.
  3. Hussaini M. Biomarkers in Hematological Malignancies: A Review of Molecular Testing in Hematopathology. Cancer Control. 2015;22(2):158–66. doi: 10.1177/107327481502200206.
  4. Forman SJ, Rowe JM. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 2013;121(7):1077–82. doi: 10.1182/blood-2012-08-234492.
  5. Im A, Pavletic SZ. Immunotherapy in hematologic malignancies: past, present, and future. J Hematol Oncol. 2017;10(1):94. doi: 10.1186/s13045-017-0453-8.
  6. Luskin MR, DeAngelo DJ. Chimeric Antigen Receptor Therapy in Acute Lymphoblastic Leukemia Clinical Practice. Curr Hematol Malig Rep. 2017;12(4):370–9. doi: 10.1007/s11899-017-0394-x.
  7. Fesnak A, June CH, Levine BL. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2016;16(9):566–81. doi: 10.1038/nrc.2016.97.
  8. Lim W, June C. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 2017;168(4):724–40. doi: 10.1016/j.cell.2017.01.016.
  9. Sadelain M, Brentjens R, Riviere I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 2013;3(4):388–98. doi: 10.1158/2159-8290.CD-12-0548.
  10. Brentjens RJ, Davila ML, Riviere I, et al. CD19-Targeted T Cells Rapidly Induce Molecular Remissions in Adults with Chemotherapy-Refractory Acute Lymphoblastic Leukemia. Sci Transl Med. 2013;5(177):177ra38. doi: 10.1126/scitranslmed.3005930.
  11. Maude SL, Frey N, Shaw P, et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells for Sustained Remissions in Leukemia. N Engl J Med. 2014;371(16):1507–17. doi: 10.1056/NEJMoa1407222.
  12. Turtle CJ, Hanafi L-A, Berger C, et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients. J Clin Invest. 2016;126(6):2123–38. doi: 10.1172/JCI85309.
  13. Lee DW, Kochenderfer JN, Stetler-Stevenson M, et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: A phase 1 dose-escalation trial. Lancet. 2015;385(9967):517–28. doi: 10.1016/S0140-6736(14)61403-3.
  14. Onea AS, Jazirehi AR. CD19 chimeric antigen receptor (CD19 CAR)-redirected adoptive T-cell immunotherapy for the treatment of relapsed or refractory B-cell Non-Hodgkin’s Lymphomas. Am J Cancer Res. 2016;6(2):403–24.
  15. Kebriaei P, Singh H, Huls MH, et al. Phase I trials using Sleeping Beauty to generate CD19-specific CAR T cells. J Clin Invest. 2016;126(9):3363–76. doi: 10.1172/JCI86721.
  16. ICML 2017: Data From the TRANSCEND Trial of JCAR017 in Relapsed and Refractory Aggressive B-Cell Non-Hodgkin Lymphoma — The ASCO Post. Available from: http://www.ascopost.com/News/57764 (accessed 7.10.2017).
  17. Locke FL, Neelapu SS, Bartlett NL, et al. Abstract CT019: Primary results from ZUMA-1: a pivotal trial of axicabtagene ciloleucel (axicel; KTE-C19) in patients with refractory aggressive non-Hodgkin lymphoma (NHL). Cancer Res. 2017;77(13 Suppl):CT019. doi: 10.1158/1538-7445.AM2017-CT019.
  18. Kalos M, Levine BL, Porter DL, et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Sci Transl Med. 2011;3(95):95ra73. doi: 10.1126/scitranslmed.3002842.
  19. Porter DL, Hwang W-T, Frey NV, et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Sci Transl Med. 2015;7(303):303ra139. doi: 10.1126/scitranslmed.aac5415.
  20. Jensen MC, Riddell SR. Designing chimeric antigen receptors to effectively and safely target tumors. Curr Opin Immunol. 2015;33:9–15. doi: 10.1016/j.coi.2015.01.002.
  21. Павлова А.А., Масчан М.А., Пономарев В.Б. Адоптивная иммунотерапия генетически модифицированными Т-лимфоцитами, экспрессирующими химерные антигенные рецепторы. Онкогематология. 2017;12(1):17–32. doi: 10.17650/1818-8346-2017-12-1-17-32. [Pavlova AА, Maschan MА, Ponomarev VB. Adoptitive immunotherapy with genetically engineered T lymphocytes modified to express chimeric antigen receptors. Oncohematology. 2017;12(1):17–32. doi: 10.17650/1818-8346-2017-12-1-17-32. (In Russ)]
  22. Dai H, Wang Y, Lu X, Han W. Chimeric Antigen Receptors Modified T-Cells for Cancer Therapy. J Natl Cancer Inst. 2016;108(7):1–15. doi: 10.1093/jnci/djv439.
  23. Abate-Daga D, Davila ML. CAR models: next-generation CAR modifications for enhanced T-cell function. Mol Ther Oncolytics. 2016;3:16014. doi: 10.1038/mto.2016.14.
  24. Holzinger A, Barden M, Abken H. The growing world of CAR T cell trials: a systematic review. Cancer Immunol Immunother. 2016;65(12):1433–50. doi: 10.1007/s00262-016-1895-5.
  25. Jensen MC, Popplewell L, Cooper LJ, et al. Antitransgene rejection responses contribute to attenuated persistence of adoptively transferred CD20/CD19-specific chimeric antigen receptor redirected T cells in humans. Biol Blood Marrow Transplant. 2010;16(9):1245–56. doi: 10.1016/j.bbmt.2010.03.014.
  26. Gong MC, Latouche JB, Krause A, et al. Cancer patient T cells genetically targeted to prostate-specific membrane antigen specifically lyse prostate cancer cells and release cytokines in response to prostate-specific membrane antigen. Neoplasia. 1999;1(2):123–7.
  27. Davila ML, Sadelain M. Biology and clinical application of CAR T cells for B cell malignancies. Int J Hematol. 2016;104(1):6–17. doi: 10.1007/s12185-016-2039-6.
  28. Park JH, Geyer MB, Brentjens RJ. CD19-targeted CAR T-cell therapeutics for hematologic malignancies: interpreting clinical outcomes to date. Blood. 2016;127(26):3312–20. doi: 10.1182/blood-2016-02-629063.
  29. Grupp S, Kalos M, Barrett D, et al. Chimeric Antigen Receptor–Modified T Cells for Acute Lymphoid Leukemia. N Engl J Med. 2013;368(16):1509–18. doi: 10.1056/NEJMoa1215134.
  30. Yu H, Sotillo E, Harrington C, et al. Repeated loss of target surface antigen after immunotherapy in primary mediastinal large B cell lymphoma. Am J Hematol. 2017;92(1):E11–E13. doi: 10.1002/ajh.24594.
  31. Sotillo E, Barrett DM, Black KL, et al. Convergence of Acquired Mutations and Alternative Splicing of CD19 Enables Resistance to CART-19 Immunotherapy. Cancer Discov. 2015;5(12):1282–95. doi: 10.1158/2159-8290.CD-15-1020.
  32. Fischer J, Paret C, El Malki K, et al. CD19 Isoforms Enabling Resistance to CART-19 Immunotherapy Are Expressed in B-ALL Patients at Initial Diagnosis. J Immunother. 2017;40(5):187–95. doi: 10.1097/CJI.0000000000000169.
  33. Jacoby E, Nguyen SM, Fountaine TJ, et al. CD19 CAR immune pressure induces B-precursor acute lymphoblastic leukaemia lineage switch exposing inherent leukaemic plasticity. Nat Commun. 2016;7:12320. doi: 10.1038/ncomms12320.
  34. Gardner R, Wu D, Cherian S, et al. Acquisition of a CD19-negative myeloid phenotype allows immune escape of MLL-rearranged B-ALL from CD19 CAR-T-cell therapy. Blood. 2016;127(20):2406–10. doi: 10.1182/blood-2015-08-665547.
  35. Zah E, Lin M-Y, Silva-Benedict A, et al. T Cells Expressing CD19/CD20 Bispecific Chimeric Antigen Receptors Prevent Antigen Escape by Malignant B Cells. Cancer Immunol Res. 2016;4(6):498–508. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-15-0231.
  36. Shah NN, Stetler-Stevenson M, Yuan CM, et al. Minimal Residual Disease Negative Complete Remissions Following Anti-CD22 Chimeric Antigen Receptor (CAR) in Children and Young Adults with Relapsed/Refractory Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL). Blood. 2016;128(22):650.
  37. Davila ML, Riviere I, Wang X, et al. Efficacy and Toxicity Management of 19-28z CAR T Cell Therapy in B Cell Acute Lymphoblastic Leukemia. Sci Transl Med. 2014;6(224):224ra25. doi: 10.1126/scitranslmed.3008226.
  38. Long AH, Haso WM, Shern JF, et al. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nat Med. 2015;21(6):581–90. doi: 10.1038/nm.3838.
  39. Hay KA, Turtle CJ. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells: Lessons Learned from Targeting of CD19 in B-Cell Malignancies. Drugs. 2017;77(3):237–45. doi: 10.1007/s40265-017-0690-8.
  40. Wehbi VL, Tasken K. Molecular mechanisms for cAMP-mediated immunoregulation in T cells – role of anchored protein kinase a signaling units. Front Immunol. 2016;7:1–19. doi: 10.3389/fimmu.2016.00222.
  41. Newick K, O’Brien S, Sun J, et al. Augmentation of CAR T-cell Trafficking and Antitumor Efficacy by Blocking Protein Kinase A Localization. Cancer Immunol Res. 2016;4(6):541–51. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-15-0263.
  42. Sanjana NE, Shalem O, Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods. 2014;11(8):783–4. doi: 10.1038/nmeth.3047.
  43. Kochenderfer JN, Feldman SA, Zhao Y, et al. Construction and Preclinical Evaluation of an Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor. J Immunother. 2009;32(7):689–702. doi: 10.1097/CJI.0b013e3181ac6138.
  44. Wang K, Wei G, Liu D. CD19: a biomarker for B cell development, lymphoma diagnosis and therapy. Exp Hematol Oncol. 2012;1(1):36. doi: 10.1186/2162-3619-1-36.
  45. Uckun FFM, Jaszcz W, Ambrus JJL, et al. Detailed Studies on Expression and Function of CD19 Surface Determinant by Using B43 Monoclonal Antibody and the Clinical Potential of Anti-CD19 Immunotoxins. Blood. 1988;71(1):13–29.
  46. Wei G, Ding L, Wang J, et al. Advances of CD19-directed chimeric antigen receptor-modified T cells in refractory/relapsed acute lymphoblastic leukemia. Exp Hematol Oncol. 2017;6(1):10. doi: 10.1186/s40164-017-0070-9.
  47. Barrett DM, Singh N, Hofmann TJ, et al. Interleukin 6 Is Not Made By Chimeric Antigen Receptor T Cells and Does Not Impact Their Function. Blood. 2016;128(22):2016–7.
  48. Singh N, Hofmann TJ, Gershenson Z, et al. Monocyte lineage-derived IL-6 does not affect chimeric antigen receptor T-cell function. Cytotherapy. 2017;19(7):867–80. doi: 10.1016/j.jcyt.2017.04.001.
  49. Hartmann J, Schussler‐Lenz M, Bondanza A, Buchholz CJ. Clinical development of CAR T cells—challenges and opportunities in translating innovative treatment concepts. EMBO Mol Med. 2017;9(9):1183–97. doi: 10.15252/emmm.201607485.
  50. Hagen T. Novartis Sets a Price of $475,000 for CAR T-Cell Therapy. Available from: http://www.onclive.com/web-exclusives/novartis-sets-a-price-of-475000-for-car-tcell-therapy (accessed 31.10.2017).
  51. Yang Y, Jacoby E, Fry TJ. Challenges and opportunities of allogeneic donor-derived CAR T cells. Curr Opin Hematol. 2015;22(6):509–15. doi: 10.1097/MOH.0000000000000181.
  52. Li H, Zhao Y. Increasing the safety and efficacy of chimeric antigen receptor T cell therapy. Protein Cell. 2017;8(8):573–89. doi: 10.1007/s13238-017-0411-9.