цитотоксический эффект

Экспериментальное исследование функциональной активности химерного антигенного рецептора NKG2D in vitro и in vivo

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ , , , , ,

К.A. Левчук1, С.А. Осипова1, А.В. Онопченко1, М.Л. Васютина1, Э.Р. Булатов2, А.Х. Валиуллина2, О.Н. Демидов1,3,4, А.В. Петухов1

1 ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341

2 ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», ул. Кремлевская, д. 18, Казань, Российская Федерация, 420008

3 ФГБУН «Институт цитологии РАН», Тихорецкий пр-т, д. 4, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 194064

4 Научно-технологический университет «Сириус», Олимпийский пр-т, д. 1, Сочи, Российская Федерация, 354340

Для переписки: Ксения Александровна Левчук, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341; e-mail: levchuk_ka@almazovcentre.ru

Для цитирования: Левчук К.A., Осипова С.А., Онопченко А.В. и др. Экспериментальное исследование функциональной активности химерного антигенного рецептора NKG2D in vitro и in vivo. Клиническая онкогематология. 2022;15(4):327–39.

DOI: 10.21320/2500-2139-2022-15-4-327-339

РЕФЕРАТ

Цель. Исследование противоопухолевого цитотоксического эффекта NKG2D CAR T-клеток и анти-CD19 CAR T-клеток in vitro и in vivo с целью сравнить противоопухолевую активность химерных антигенных рецепторов (CAR) разного структурно-функционального состава.

Материалы и методы. Конструкции CAR были получены с помощью молекулярного клонирования; CAR T-клеточные популяции — путем трансдукции Т-лимфоцитов здорового донора рекомбинантными лентивирусными частицами, несущими последовательность CAR NKG2D или CAR к антигену-мишени CD19. Долю CAR T-клеток оценивали по флюоресценции белка FusionRed и по визуализации мембранного рецептора EGFR. Специфическую цитотоксическую активность эффекторных CAR T-клеток анализировали in vitro с помощью теста цитотоксичности в реальном времени (RTCA) при сокультивировании с клетками-мишенями линии HeLa_CD19, используя систему xCELLigence. Анализ синтеза интерферона-γ (IFN-γ) in vitro и in vivo и наличия цитотоксического эффекта проводили, используя иммуноферментный анализ культуральной среды сокультивированных клеток-эффекторов и мишеней, а также выделенной аутоплазмы периферической крови мышей. Для оценки функциональной активности клеток in vivo субпопуляции CAR-T (10 млн клеток/мышь) вводили иммунодефицитным мышам линии NSG-SGM3 спустя 12 дней после инъекции клеток линии HeLa_CD19 и подтверждения приживления и роста опухоли. Опухоли удаляли после эвтаназии и фиксировали в парафине для подготовки гистологических срезов. Анализ CAR T-клеточной инфильтрации опухолей осуществляли путем оценки иммуногистохимического окрашивания по антигену CD3.

Результаты. Наивысшие уровни экспрессии лигандов (молекул MICA, ULBP1/2/3/4/5/6) обнаружены в клеточной линии HeLa. Полученные NKG2D CAR T-клетки характеризуются значительным цитотоксическим эффектом против линии-мишени HeLa_CD19 (клеточный индекс [КИ] = 1,27), но сниженным в 2 раза по сравнению с анти-CD19 CAR T-клетками (КИ = 0,60) (p = 0,0038). Уровень IFN-γ при сокультивировании анти-CD19 CAR T-клеток с HeLa_CD19 в соотношении Е/Т = 1:1 составил 64 852 пкг/мл, что в 3,5 раза больше уровня IFN-γ при сокультивировании NKG2D CAR T-клеток с HeLa_CD19 (18 635 пкг/мл) (p = 0,0360). Степень инфильтрации опухоли анти-CD19 CAR T-клетками была выше таковой у NKG2D CAR T-клеток. Отсутствие пролиферирующих NKG2D CAR T-клеток в периферической крови мышей подтверждает низкую их персистенцию. Концентрация IFN-γ в аутоплазме мышей из группы с введением анти-CD19 CAR T-клеток составила 11,89 пкг/мл, а в группе с введением NKG2D CAR T-клеток — 0,57 пкг/мл (p = 0,0079). Средняя масса опухолевых ксенографтов экспериментальных групп спустя 10 дней после введения анти-CD19 CAR T-клеток составила 0,72 г (p = 0,0142), Т-лимфоцитов и NKG2D CAR T-клеток — 2,12 и 1,2 г соответственно.

Заключение. Анти-CD19 CAR T-клетки характеризуются более выраженным цитотоксическим эффектом как in vitro, так и in vivo экспериментальных условиях по сравнению с NKG2D CAR T-клетками. Степень пролиферации анти-CD19 CAR T-клеток и их инфильтрации в мышиных ксенографтных моделях в значительной степени выше уровней, полученных в случае инъекции NKG2D CAR T-клеток. Однократное введение NKG2D CAR T-клеток способствует лишь кратковременному уменьшению опухоли.

Ключевые слова: CAR T-клеточная терапия, химерный антигенный рецептор NKG2D, костимулирующие домены, лиганды NKG2D, цитотоксический эффект, инфильтрация CAR T-клеток, персистенция CAR T-клеток.

Получено: 27 июня 2022 г.

Принято в печать: 12 сентября 2022 г.

Читать статью в PDF

Статистика Plumx русский

ЛИТЕРАТУРА

  1. Saez-Borderias A, Guma M, Angulo A, et al. Expression and function of NKG2D in CD4+ T cells specific for human cytomegalovirus. Eur J Immunol. 2006;36(12):3198–206. doi: 10.1002/eji.200636682.
  2. Allez M, Tieng V, Nakazawa A, et al. CD4+NKG2D+ T cells in Crohn’s disease mediate inflammatory and cyto-toxic responses through MICA interactions. Gastroenterology. 2007;132(7):2346–58. doi: 10.1053/j.gastro.2007.03.025.
  3. Dai Z, Turtle CJ, Booth GC, et al. Normally occurring NKG2D+CD4+ T cells are immunosuppressive and inversely correlated with disease activity in juvenile-onset lupus. J Exp Med. 2009;206(4):793–805. doi: 10.1084/jem.20081648.
  4. Raulet DH. Roles of the NKG2D immunoreceptor and its ligands. Nat Rev Immunol. 2003;3(10):781–90. doi: 10.1038/nri1199.
  5. Le Bert N, Gasser S. Advances in NKG2D ligand recognition and responses by NK cells. Immunol Cell Biol. 2014;92(3):230–6. doi: 10.1038/icb.2013.111.
  6. Rabinovich B, Li J, Wolfson M, et al. NKG2D splice variants: a reexamination of adaptor molecule associations. Immunogenetics. 2006;58(2–3):81–8. doi: 10.1007/s00251-005-0078-x.
  7. Lanier LL. DAP10- and DAP12-associated receptors in innate immunity. Immunol Rev. 2009;227(1):150–60. doi: 10.1111/j.1600-065X.2008.00720.x.
  8. Raulet DH, Gasser S, Gowen BG, et al. Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor. Annu Rev Immunol. 2013;31(1):413–41. doi: 10.1146/annurev-immunol-032712-095951.
  9. Luo QZ, Lin L, Gong Z, et al. Positive association of major histocompatibility complex class I chain-related gene A polymorphism with leukemia susceptibility in the people of Han nationality of Southern China. Tissue Antigens. 2011;78(3):178–84. doi: 10.1111/j.1399-0039.2011.01748.x.
  10. Kim H, Byun JE, Yoon SR, et al. SARS-CoV-2 peptides bind to NKG2D and increase NK cell activity. Cell Immunol. 2022;371:104454. doi: 10.1016/j.cellimm.2021.104454.
  11. Farzad F, Yaghoubi N, Jabbari-Azad F, et al. Prognostic Value of Serum MICA Levels as a Marker of Severity in COVID-19 Patients. Immunol Invest. 2022:1–11. doi: 10.1080/08820139.2022.2069035.
  12. Groh V, Rhinehart R, Randolph-Habecker J, et al. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat Immunol. 2001;2(3):255–60. doi: 10.1038/85321.
  13. Ehrlich LI, Ogasawara K, Hamerman JA, et al. Engagement of NKG2D by cognate ligand or antibody alone is insufficient to mediate costimulation of human and mouse CD8+ T cells. J Immunol. 2005;174(4):1922–31. doi: 10.4049/jimmunol.174.4.1922.
  14. O’Hayre M, Salanga CL, Handel TM, Allen SJ. Chemokines and cancer: migration, intracellular signalling and intercellular communication in the microenvironment. Biochem J. 2008;409(3):635–49. doi: 10.1042/BJ20071493.
  15. Zhang T, Lemoi BA, Sentman CL. Chimeric NK-receptor-bearing T cells mediate antitumor immunotherapy. Blood. 2005;106(5):1544–51. doi: 10.1182/blood-2004-11-4365.
  16. Zhang T, Barber A, Sentman CL. Generation of antitumor responses by genetic modification of primary human T cells with a chimeric NKG2D receptor. Cancer Res. 2006;66(11):5927–33. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-06-0130.
  17. Chang YH, Connolly J, Shimasaki N, et al. A chimeric receptor with NKG2D specificity enhances natural killer cell activation and killing of tumor cells. Cancer Res. 2013;73(6):1777–86. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-12-3558.
  18. Song DG, Ye Q, Santoro S, et al. Chimeric NKG2D CAR-expressing T cell-mediated attack of human ovarian cancer is enhanced by histone deacetylase inhibition. Hum Gene Ther. 2013;24(3):295–305. doi: 10.1089/hum.2012.143.
  19. Lehner M, Gotz G, Proff J, et al. Redirecting T cells to Ewing’s sarcoma family of tumors by a chimeric NKG2D receptor expressed by lentiviral transduction or mRNA transfection. PLoS One. 2012;7(2):e31210. doi: 10.1371/journal.pone.0031210.
  20. Sentman CL, Meehan KR. NKG2D CARs as cell therapy for cancer. Cancer J. 2014;20(2):156–9. doi: 10.1097/PPO.0000000000000029.
  21. Barber A, Zhang T, DeMars LR, et al. Chimeric NKG2D receptor-bearing T cells as immunotherapy for ovarian cancer. Cancer Res. 2007;67(10):5003–8. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-06-4047.
  22. Chang YH, Connolly J, Shimasaki N, et al. A chimeric receptor with NKG2D specificity enhances natural killer cell activation and killing of tumor cells. Cancer Res. 2013;73(6):1777–86. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-12-3558.
  23. Barber A, Meehan KR, Sentman CL. Treatment of multiple myeloma with adoptively transferred chimeric NKG2D receptor-expressing T cells. Gene Ther. 2011;18(5):509–16. doi: 10.1038/gt.2010.174.
  24. Smith AJ, Oertle J, Warren D, Prato D. Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy for malignant cancers: Summary and perspective. J Cell Immunother. 2016;2(2):59–68. doi: 10.1016/j.jocit.2016.08.001.
  25. Ng YY, Tay JCK, Li Z, et al. T Cells Expressing NKG2D CAR with a DAP12 Signaling Domain Stimulate Lower Cytokine Production While Effective in Tumor Eradication. Mol Ther. 2021;29(1):75–85. doi: 10.1016/j.ymthe.2020.08.016.
  26. Fontaine M, Demoulin B, Bornschein S, et al. Next generation NKG2D-based CAR T-cells (CYAD-02): co-expression of a single shRNA targeting MICA and MICB improves cell persistence and anti-tumor efficacy in vivo. Blood. 2019;134(Suppl_1):3931. doi: 10.1182/blood-2019-129998.
  27. Breman E, Demoulin B, Agaugue S, et al. Overcoming Target Driven Fratricide for T Cell Therapy. Front Immunol. 2018;9:2940. doi: 10.3389/fimmu.2018.02940.